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水貂眼炎双球菌病的病原分离鉴定及治疗

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发表于 2020-1-16 20:36:16 |显示全部楼层
水貂眼炎双球菌病的病原分离鉴定及治疗
禚宝山 李富金 李金波 秦绪伟 赵远
齐鲁动物保健品有限公司 济南 250100
摘要:秋季水貂流泪湿眼圈是近几年水貂常见病,病因不详,本研究对山东发病貂的眼炎进行了病原筛选,棉拭子沾取眼结膜分泌物进行了犬瘟热、支原体PCR检测,结果显示:犬瘟热阴性,支原体阳性;眼结膜棉式子细菌培养,不同场水貂均分离到相同细菌,经纯化培养、染色镜检、生化试验、溶血试验和PCR检测等试验,鉴定为双球菌。对分离到的双球菌及棉式子浸出过滤液进行动物回归实验,结果显示:单点双球菌及支原体滤液与双球菌混合液可复制出水貂眼炎,而单点支原体滤液不能复制水貂眼炎。分离菌对头孢氨苄、复方阿莫西林、新霉素、丁胺卡那霉素高度敏感,敏感药治疗眼炎有效。
关键词:水貂 眼炎双球菌 分离鉴定
    双球菌是链球菌科双球菌属的细菌,该菌广泛分布于自然界中,常在于健康人、动物的体表、粘膜上寄生,主要引起肺炎、支气管炎、脑膜炎、尿道炎、中耳炎、败血症等疾病。资料显示,双球菌有广泛的宿主,可以感染人与猪、羊、兔、水貂、狐狸、貉、犬、大熊猫等多种动物。本菌感染动物不同器官而引起不同病症,其发病率、死亡率也因菌株本身致病性、感染动物的易感性及感染器官不同而差异悬殊。目前,国内对动物双球菌报道不多,且多集中在肺炎双球菌,几乎没有眼炎双球菌的报道。
近几年,水貂秋季流泪湿眼圈临床病例增多,以白貂多发,其他品种貂也有发生,轻重不一,有人怀疑是慢性犬瘟热,有人怀疑是饲料、营养、环境等非传染性因素引起,也有人认为是其他致病菌引起,众说纷纭,因很少引起死亡,且能自愈,因此关注的人不多,没有文献可查。2018年10月,我们对山东临沂、青岛地区的两个发生眼炎的水貂场进行了临床调查、病原分离鉴定、动物回归等实验室检测,结果显示,分离到的双球菌可以复制眼炎,通过药敏试验,筛选敏感药物,快速治愈,为该病的防治提供重要参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集
将发病水貂保定后,用灭菌棉拭子沾取眼结膜、角膜的分泌物,每个场采集6只水貂分泌物棉式子。
1.1.2 培养基
血清营养琼脂培养基、麦康凯培养基、鲜血琼脂培养基及SS培养基,均由齐鲁动物保健品有限公司生药研究所(山东省兽用生物制品工程实验室)提供
1.1.3 试验动物
健康青年水貂8只,购自章丘某水貂场。
1.1.4 药敏片
氨苄青霉素、安普霉素、新霉素、丁胺卡那霉素、庆大霉素、环丙沙星、恩诺沙星、氟哌酸、林可霉素、大观霉素、磷霉素购自杭州滨和微生物试剂有限公司。
1.1.5 引物
犬瘟热、细菌16S及支原体引物均由齐鲁动物保健品有限公司生药研究所(山东省兽用生物制品工程实验室)提供。
1.1.6 仪器设备及其他实验用品
PCR仪A300型号,购自杭州朗基科学仪器有限公司;电热恒温培养箱DNP-9162型号,购自上海精宏实验设备有限公司;显微镜CX-31,购自日本奥林巴斯;0.22um针头滤器,购自Merck Millipore;染色液、离心管等实验室常用材料及设备均由齐鲁动物保健品有限公司生药研究所(山东省兽用生物制品工程实验室)提供。
1.2方法
1.2.1现场调查
走访临沂沂南、青岛胶南两个水貂场,现场调查养殖环境、发病时间、临床症状、发病率、病死率等。
1.2.2细菌分离纯化
把沾取了眼分泌液的棉式子,依次划线接种血清琼脂培养基、麦康凯培养基及SS培养基,37℃恒温箱过夜。对分离到的细菌,挑取典型菌落,分区划线接种血清琼脂培养基进行再次纯化培养。
1.2.3 PCR
将棉式子集中,加生理盐水5ml,离心,取上清液,按照常规方法提取
1.2.4染色镜检
挑取典型分离菌落涂片,革兰氏染色,油镜观察。
1.2.5生化试验
采取常规生理生化试验方法[1],将纯化后细菌接种到乳糖、麦芽糖、葡萄糖、菊糖、棉实糖及海藻糖等多种糖、甘露醇、梨醇、触媒、胆盐等微量发酵管中,置37℃恒温培养箱,培养24~48小时,观察记录结果。
1.2.6溶血试验
将纯化后的细菌,挑取典型菌落,划线接种于绵羊鲜血琼脂培养基,置37℃恒温培养箱,培养18-24小时,观察记录结果。
1.2.7药敏试验
采用药敏纸片琼脂扩散法,将分离纯化的细菌划线在血清琼脂培养基上,再将药敏片贴在培养基上,置37℃恒温培养箱,培养18~24小时,观察记录结果。
1.2.8 动物回归试验
将8只健康青年水貂随机分为4组,其中3组为试验组,另1组为对照。试验1组,水貂2只,用双球菌培养液点眼;试验2组,水貂2只,用棉式子支原体液点眼;试验3组,水貂2只,用双球菌与棉式子支原体滤液混合后点眼;对照组,用生理盐水点眼。点眼后观察试验貂眼睛是否有红肿、流泪现象,连续观察5天,如果复制出病症,则观察7天以上观察炎症发展情况。
2 结果
2.1现场调查结果
临沂的水貂场是一个拥有10000种貂的规模场,场内设施设备齐全,老板从事水貂养殖多年,有丰富养殖经验,第一次遇到这种病症;青岛的水貂场规模1000种貂,老板有30多年的养殖经验,设施设备简陋,但干净卫生,两个场发病时间均在9月20号左右,并且周围貂场也有不少出现这种病症。临床症状相似,表现为貂群中公貂突然有因流眼泪而湿眼圈的,传播快,开始主要是流眼泪,有单眼流泪的,多数两个眼都流泪,7~8天左右达到发病高峰,持续约20多天,发病率5%~30%,几乎没有死亡,极个别因感染其他疫病死亡,有人怀疑是非典型性犬瘟热,做了犬瘟热疫苗免疫,有人认为湿眼圈病是季节病,不用治疗,过了立冬就自己好了。做犬瘟热疫苗的效果不明显,仍然有水貂陆续出现,没有并发感染则很少有死亡。投喂抗生素能减轻症状。
2.2细菌分离纯化
两个不同地区不同养殖场采集的棉式子,分离到相同的菌,分离菌在血清琼脂培养基上生长良好,形成细小、圆形、光滑、扁平菌落,麦康凯平板、SS琼脂平板均不生长。
2.3 PCR扩增
犬瘟热阴性,双球菌及支原体阳性。

图1 PCR检测电泳图谱
(注:M:DL2000 Marker;1:CDV阳性对照;2:CDV阴性对照;3:样品CDV样品检测;4:样品双球菌检测;5:双球菌阴性对照;6:支原体阳性对照;7:支原体阴性对照;8:样品支原体检测)
2.4染色镜检
视野中可见有革兰氏阳性球菌,菌体呈现卵圆形,多数成双排列,为双球状。

2.5生化试验
分离菌可分解乳糖、麦芽糖、葡萄糖、菊糖、棉实糖及海藻糖,不分解甘露醇和梨醇,触媒试验阴性,胆盐溶解阳性。
2.6溶血试验
在鲜血琼脂培养基上生长良好,形成细小、透明菌落,有明显的溶血环。
2.7药敏试验
分离菌对头孢氨苄、复方阿莫西林、新霉素、丁胺卡那霉素高度敏感,环丙沙星、恩诺沙星中敏,庆大霉素、氟哌酸、林可霉素、大观霉素、磷霉素不敏感。
2.8 动物回归试验
实验1组、实验3组水貂点眼后第二天均出现了羞明流泪临床症状,实验2组及对照组水貂正常。
2.9 病貂治疗
选择敏感药头孢氨苄溶液点眼,3天后发病水貂眼炎恢复。
3 小结与讨论
3.1 引起水貂眼炎的因素很多,如维生素A缺乏、严重脂肪肝或者黄脂肪病等其他肝病发生,环境中有氨气、刺激性消毒剂等化学物质刺激均能引起非传染性眼炎,若群中发病个体多,常误以为是传染病,条件改善,疫病很快消除,有别于传染性因素,本文案例通过调查养殖场环境、饲养管理等,排除了非传染因素。
3.2 眼睛感染支原体或绿脓杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、双球菌等细菌会引起具有传染性的眼炎,犬瘟热等全身性疾患也有眼炎症状,为了筛查本案例的真正病原,实验室做了犬瘟热、支原体PCR检测,进行了细菌分离,从结果上看,排除了犬瘟热,分离到细菌,支原体PCR阳性,怀疑是可能与这两种或者其中一种病原有关。
3.3 分离菌经染色镜检,纯化培养、生化试验、溶血试验、PCR检测,确定为致病性双球菌。
3.4动物回归试验结果显示,双球菌是本案例的致病原,单纯支原体并不能复制出临床症状,排除了支原体单独或者联合致病的可能。
3.5每年秋季,部分貂场的水貂出现流眼泪、湿眼圈及流眼眵等病症,一段时间后该病症可以自愈,因为很少引起死亡,所以很少有人研究其病因,本研究从眼炎病例分离到双球菌,并复制出病症,确诊为眼炎双球菌,证实了双球菌是秋季水貂湿眼圈病的病因之一。
3.6该病很少引起死亡,但是有一定传染性,环境中病菌一旦感染其他器官,可能会一起其他损失,不得不防。
3.7 通过药敏试验发现,分离菌株耐药性并不强,敏感药物比较多,氨苄青霉素溶液点眼,效果显著,但应该注意,直接点眼治疗,选择的药物需要稀释后不能伤害眼及眼结膜。

参考文献
[1] 陆承平.兽医微生物学[M].5版.北京:中国农业出版社,2013:83-90
[2] 莫玲.王文秀.刘吉山等. 兔肺炎双球菌病的病原分离鉴定及治疗[J].动物医学进展.2014,35(11):127-130
[3] 秦绪伟.禚宝山.水貂肺炎双球菌的分离与鉴定[J].山东畜牧兽医.2014 (6):11-12
[4] 王春花,李德生,王承东等.大熊猫源肺炎双球菌的分离鉴定[J].黑龙江畜牧兽医 .2012(1):85-87
[5] 秦绪伟 青燕獭兔肺炎双球菌的诊断与治疗[J]中国养兔 2017(4):39-40
[6] 张庆明.一例水貂双球菌病的诊治[J].北方牧业.2016(19):31
[7] 秦绪伟.一例狐狸肺炎双球菌病诊治[J].山东畜牧兽医.2016(10):35
[8] 王春富.一起貉肺炎双球菌感染病例[J].北方牧业.2016(12):31

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